本產(chǎn)品是基于熒光染料檢測(cè)的即用型 RT-PCR 試劑盒，可以對(duì)靶 RNA 分子進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR 分析（quantitative RT-PCR、qRT-PCR）。產(chǎn)品含有經(jīng)過(guò)優(yōu)化的緩沖液組分、逆轉(zhuǎn)錄酶、熱啟動(dòng) Taq DNA 聚合酶、Taq DNA 穩(wěn)定劑、dNTPs、MgCl2 和穩(wěn)定劑等所有實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 所需要的成分，用戶(hù)只需加入 RNA 模板和引物即可進(jìn)行染料法實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 反應(yīng)，具有廣泛的用途。

中文名稱(chēng)：一步式染料法qRT-PCR試劑盒

英文名稱(chēng)：One-Step SYBR qRT-PCR Kit

規(guī)格及成分

低溫運(yùn)輸，-20℃保存, 不凍融時(shí)保存期限為 12 個(gè)月。如果需要每天使用，可在 4℃放置三周。

自備試劑：RNA 模板、引物、超純水。

一步式染料法qRT-PCR試劑盒具有下列特點(diǎn)：

1.以 2×Mix 提供，用戶(hù)只需準(zhǔn)備模板、引物和 ROX 染料（取決于 qPCR 儀器）即可以進(jìn)行染料法實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 實(shí)驗(yàn)，非常方便快捷，降低了操作誤差。 2.各成分的濃度和比例都經(jīng)過(guò)精心優(yōu)化，反應(yīng)的靈敏度高，特異性強(qiáng)。靈敏度最高時(shí)可以達(dá)到 50 拷貝/反應(yīng)（跟模板質(zhì)量，引物設(shè)計(jì)等相關(guān)）。3.靈敏度和專(zhuān)一性比常規(guī) RT-PCR 更高。 4.可用于基因表達(dá)分析、SNP 分析、拷貝數(shù)分析等實(shí)驗(yàn)。也可以用于定性檢測(cè)。5.本產(chǎn)品只能用于科研，1mL 足夠 100 次 20uL 體系的染料法 qRT-PCR 反應(yīng)。

使用方法:

如果有 N 個(gè)樣品并且做定量分析，最好設(shè)置 N+7 個(gè)反應(yīng)，多出的 7 個(gè)中，6 個(gè)是做標(biāo)準(zhǔn)曲線的陽(yáng)性對(duì)照，一個(gè)是陰性對(duì)照（NC）。在 N+7 個(gè) PCR 管中，加入下列成分。如果是做定性分析，則 6 個(gè)做標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品縮減成一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照（PC），用戶(hù)自己需要根據(jù)下表進(jìn)行適當(dāng)修改（把 6 個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)改成 1 個(gè)陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)）。

成分N 個(gè)樣品管6 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線管NC 管2×染料法 qRT-PCR 緩沖液 各 10 uL 各 10 uL 10 uL自備引物 1（10uM） 各 1 uL 各 1 uL 1 uL自備引物 2（10uM） 各 1 uL 各 1 uL 1 uLN 個(gè)自備模板 RNA 各 1-2 uL 不加 不加自備陽(yáng)性對(duì)照模板（6 個(gè)梯度） 不加 各 1 uL（1 管加 1 個(gè)梯度） 不加陰性對(duì)照模板（水） 不加 不加 1 uL自備 50×ROX I 染料或自備 50×ROX II 染料（見(jiàn)注）各 0.4 uL 各 0.4 uL 0.4 uL10×染料法 qRT-PCR 酶混合液 2 uL 2 uL 2 uL補(bǔ)超純水到 20 uL 20 uL 20 uL

注，下列信息僅供參考，具體以 qPCR 儀器的使用手冊(cè)為準(zhǔn)。1、不需要 ROX 的機(jī)型：Agilent MX3000 和 MX4000、iCycler IQ、LightCycler 480、，、Smart Cycler System、Thermal Cycler Dice Real Time System 等型號(hào)的熒光 PCR 儀器不需要加 ROX 染料，但加入的話(huà)也不會(huì)影響整個(gè) PCR 分析。2、需要使用 ROX I 的機(jī)型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step One、StepOne Plus。3、需要使用 ROX II 的機(jī)型：ABI Prism7500、7500 Fast、MJ Opticon、MJ Chromo4、Corbett RotorGene 3000。2. 放入熒光 PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增, 下表的擴(kuò)增參數(shù)僅供參考，一定需要根據(jù)靶分子長(zhǎng)度，引物的 Tm 值等進(jìn)行調(diào)節(jié)。一般選擇三步法 PCR：

數(shù)據(jù)處理如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性。一般情況下，陰性對(duì)照 Ct 大于或等于 40（閾值需要以陰性對(duì)照的 Ct 值確定，此處為便于敘述以 40 為例，具體情況很可能閾值不一樣）。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽(yáng)性。如果在35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽(yáng)性。