中文名稱：免RNA提取RT-PCR試劑盒

英文名稱：Cell Lysate RT-PCR Kit

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期兩年

自備試劑

RT 引物、PCR 引物對(duì)

規(guī)格及成分

使用方法

注意：無(wú) RNase 的環(huán)境和使用無(wú) RNase 污染的試劑是本實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。

強(qiáng)烈建議使用優(yōu)利科的固相 RNase 清除劑去除工作臺(tái)面的 RNase，用氣相

RNase 去除空氣中的 RNase。實(shí)驗(yàn)前需要將 95%乙醇放-70℃預(yù)冷，最好用空槍頭盒盛乙醇。

一、細(xì)胞培養(yǎng)、裂解

1.     按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞、胰/酶消化并計(jì)數(shù)。

2.     轉(zhuǎn)移 1×10E5 個(gè)細(xì)胞到離心管中，400×g 離心 4 分鐘。

3.     吸棄上清（即培養(yǎng)基），保留細(xì)胞沉淀。

4.     用 0.5 mL 溶液 A 重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整到 2×10E5 細(xì)胞/mL。

5.     轉(zhuǎn)移 10 µL 的懸浮細(xì)胞到 0.2 mL PCR 管中，并加入 10 µL 的溶液 B，此時(shí)細(xì)胞終濃度為 10E5 細(xì)胞/mL。

6.     迅速將離心管插入浮子中，放入-70℃預(yù)冷的、95%乙醇中 1-3 分鐘。10 µL 槍頭盒一般能讓 0.2 mL 的 PCR 管一半沒(méi)入到乙醇中。

7.     在室溫的水浴鍋中快速解凍細(xì)胞，渦旋 10 秒后短暫離心數(shù)秒，將管中液體

（細(xì)胞裂解液）轉(zhuǎn)移到新的離心管中，放冰上待用。

二、RT（逆轉(zhuǎn)錄）反應(yīng)合成 cDNA

8.     按下表設(shè)置 RT 反應(yīng)體系（以 20 µL 體系為例）:

9 .     2℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應(yīng)。

10.     70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng)，然后放冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為 PCR 模板使用，不需要純化。也可以放置在-20℃長(zhǎng)期保存

三、PCR 方案一（RT 產(chǎn)物全部用于 PCR）

11.     在上步的 RT 反應(yīng)管中直接按下表加入各成分（以 100 µL 體系為例）：

  12.    直接進(jìn)入第 14 步。

四、PCR 方案二（部分 RT 產(chǎn)物用于 PCR）

13.    按下表設(shè)置 PCR 反應(yīng)體系（以 30 µL 體系為例）：

注意：RT 引物可以用做反向 PCR 引物。

14.    PCR 反應(yīng)參數(shù)(需要根據(jù)模板和引物 Tm 值決定，下面的參數(shù)只做參考)：

五、電泳檢測(cè)

15.    取 5-10 µL PCR 產(chǎn)物直接在瓊脂糖凝膠上電泳，跟分子量標(biāo)準(zhǔn)比較估計(jì)出擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。注：本試劑盒中的 PCR mix 含有甘油和染料，可以直接上樣，不需要額外再加電泳上樣液。

免RNA提取RT-PCR試劑盒

特點(diǎn)如下：

1.     免 RNA 提取，從細(xì)胞裂解到 RT-PCR 或?qū)崟r(shí)定量 RT-PCR 結(jié)果只需三個(gè)步驟，省略了整個(gè) RNA 提取過(guò)程。

2.     靈敏度不低于常規(guī)方法（先提總 RNA 再進(jìn)行 RT-PCR），不但可以檢測(cè)到低拷貝的 RNA，還可用于檢測(cè) miRNA。

3.     整合了去除基因組 DNA 的步驟，只檢測(cè) RNA，無(wú)需擔(dān)心基因組 DNA 的污染。

4.     每次只需要 10-100000 個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞或含相應(yīng)細(xì)胞數(shù)的痕量組織（如 LCM 樣品），驗(yàn)證過(guò)的細(xì)胞包括 Hela、CHO、293、COS-7 等，但不能用于 U937 細(xì)胞系。

5.     兩步法 RT-PCR，后續(xù)使用靈活。得到的 cDNA 既可用于普通 PCR，也可用于基于 SYBR 的熒光定量 PCR，也可用于其他定量 PCR（如 TaqMan）， 非常靈活。

6.     即適用于少量樣品，也適用于平行處理大量樣品及高通量篩查。

7.     本產(chǎn)品足夠用于 50 次 20µL 體系的 RT 和 600 次 30µL 體系（或約 200 次100µL 體系）的 PCR。