【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：豬肺炎支原體（MHP）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name：Mycoplasma hyopneumoniae Detection Kit（Real-Time PCR Method）

【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒

【預(yù)期用途】

豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae, MHP）可引起豬支原體肺炎，該病又稱豬霉形體肺炎或豬氣喘病，是豬的一種高發(fā)性的慢性呼吸道傳染病，主要臨床表現(xiàn)為咳嗽和氣喘，病理變化以患豬肺心葉、尖葉的背側(cè)和橫隔葉的前端肉樣病變?yōu)樘卣鱗1]。該病一年四季均可發(fā)病，但以冬、春寒冷季節(jié)較常見，各種日齡豬均可發(fā)病。    病豬生長緩慢，飼料利用率低，給世界各國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。

本試劑盒適用于檢測氣管分泌物拭子、肺組織等樣本中的豬肺炎支原體，用于豬肺炎支原體感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒對豬肺炎支原體基因保守區(qū)設(shè)計特異性的引物和探針[2-3]，用熒光 PCR 技術(shù)對豬肺炎支原體的DNA

進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

包裝規(guī)格25T/盒50T/盒

MHP 反應(yīng)液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

MHP 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺豬，無菌采集肺病變部位或病變/非病變部位交界處的樣品；生豬滅菌棉拭子沾取氣管分泌物，   放入無菌試管中

【保存和運輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標(biāo)本運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸， 嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入

1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL

滅菌離心管中；棉拭子取 100μL 進(jìn)行提取。

1.2 核酸提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取，   請按照試劑說明書進(jìn)行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑MHP 反應(yīng)液酶液

用量（樣本數(shù)為 N）20μL1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21μL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇

ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃10min否

240 cycles94℃15sec否

55℃30sec是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值（一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)）、stop 值（一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)），以及 Threshold的 Value 值（上下拖動閾值線至高于陰性對照），重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；

可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復(fù)檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長曲線， 判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

7.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3.陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6.試劑運輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1]李瑩瑩,何穎, 趙武, 等。豬支原體肺炎研究進(jìn)展[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2013,34（10）: 95-100

[2]張旭, 白方方, 武昱孜,  等. PCR 技術(shù)檢測豬支原體肺炎的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報, 2012（5）: 54-60.

[3]Dubosson C R, Conzelmann C, Miserez R, et al. Development of two real-time PCR assays for the detection of Mycoplasma hyopneumoniae in clinical samples [J]. Veterinary microbiology, 2004, 11: 55-65.