總抗氧化能力 (ABTS 法)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100T/96S

注　意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

研究意義：

測(cè)定對(duì)象中各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成總抗氧化水平。在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究中常常檢測(cè)血漿、血清、唾液、尿液等各種體液，細(xì)胞或組織等裂解液、植物或中草藥抽提液及各種抗氧化物(antioxidant)溶液的總抗氧化能力。

測(cè)定原理：

ABTS 法是使用Z廣泛的間接檢測(cè)方法，可用于親水性和親脂性物質(zhì)抗氧化能力測(cè)定。ABTS經(jīng)氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽(yáng)離子自由基 ABTS+，能溶于水相或酸性乙醇介質(zhì)中，在 734nm 處有最大吸收。被測(cè)物質(zhì)加入 ABTS+溶液后，所含抗氧化成分能與 ABTS+發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色。在 734nm 檢測(cè)吸光度的變化，并以 Trolox 作為對(duì)照體系量化抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力。

自備實(shí)驗(yàn)用品：

恒溫水浴鍋、低溫離心機(jī)、酶標(biāo)儀、96 孔板和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體 120mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 24mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑二：粉劑×2 瓶，4℃避光保存。

樣品的制備：

(1)     血清、血漿、唾液或尿液等液體樣品

血漿（制備時(shí)可以使用肝素或檸檬酸鈉抗凝，不宜使用 EDTA  抗凝）4℃，5000rpm 離心

10min，取上清待測(cè)。血清、唾液或尿液樣品直接用于測(cè)定，也可以-80℃凍存（不宜超過(guò)

30   d）后再測(cè)定。

(2) 組織樣品

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

(3) 細(xì)胞樣品

按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎（功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；10000g，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

操作步驟：

1、 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 734nm。

2、 工作液的配置：臨用前取試劑二一瓶，加入 11mL 試劑一，震蕩混勻 20min 后，靜置，

取上清使用。（注意，現(xiàn)配現(xiàn)用）

3、操作表（在 EP 管中反應(yīng)）

充分混勻，10min 內(nèi)測(cè)定 734nm 吸光值，△A= A 空白-A 測(cè)定

注意：空白管只需測(cè)定一次，吸取工作液時(shí)不要吸到底部沉淀，若 A 測(cè)定小于 0.4，需用提取

液稀釋后檢測(cè)。

總抗氧化能力計(jì)算公式：

1、以自由基清除率表示：

ABTS 自由基清除率（％）=（A 空白-A 測(cè)定）÷A 空白×100％

2、以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上獲得的抗氧化劑 Trolox 的量表示：

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y = 0.7021x - 0.0012                R2 = 0.9985                 x:Trolox 濃度(μmol/mL)

y:吸光值差值△A

單位定義:以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上獲得的抗氧化劑 Trolox 的量來(lái)表示樣本的 ABTS 自由基清除能力。（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算

總抗氧化能力（μmol Trolox/g 鮮重）=（△A+0.0012）÷0.7021×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W) =1.424×（△A+0.0012）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算

總抗氧化能力（μmol Trolox/mg prot）=（△A+0.0012）÷0.7021×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×Cpr) =1.424×（△A+0.0012）÷Cpr

(3)   按細(xì)胞計(jì)算

總抗氧化能力（μmol Trolox/104cell）=（△A+0.0012）÷0.7021×V 樣÷（V 樣÷V 樣總×細(xì)胞

數(shù)量（萬(wàn)個(gè)））

= 1.424×（△A+0.0012）÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

（3）按液體體積計(jì)算

總抗氧化能力（μmol Trolox/mL）=（△A+0.0012）÷0.7021 =1.424×（△A+0.0012）

V   樣總：加入提取液體積，1 mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，10μL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL

注意事項(xiàng)：

1.        盡量避免使用在中堿性條件下呈藍(lán)色或接近藍(lán)色的試劑，否則對(duì)本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾。

2.        樣品中不宜添加 Tween、Triton 和 NP-40 等去垢劑和 DTT、巰基乙醇等影響氧化還原反應(yīng)的還原劑。