維生素B1（Vitamin B1，VB1）試劑盒說(shuō)明書(shū)

 微量法100T/96S

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

維生素B1（Vitamin B1）是構(gòu)成脫羧輔酶的主要成分，參與細(xì)胞代謝中的三羧酸循環(huán)，是維持機(jī)體正常代謝必須的水溶性維生素，在生物體能量代謝中有重要的作用。

測(cè)定原理：

VB1在堿性條件下還原鐵氰hua鉀生成亞鐵氰hua鉀，亞鐵氰hua鉀與Fe³⁺在弱酸條件下生成普魯士藍(lán)，在704nm有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、研缽、離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體70mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體1mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體2mL×1支，4℃保存。

試劑三：液體2mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑四：液體5mL×1瓶，4℃保存。

試劑五：液體3mL×1瓶，4℃避光保存。

樣本處理：

1.        組織：將樣品磨碎，按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g，加入0.6mL提取液）加入提取液，60℃浸提30min，加蒸餾水0.4mL，混勻后于25℃，16000rpm離心10min，取上清測(cè)定（動(dòng)物組織等蛋白含量較高的樣本建議離心20-30min）。

2.        細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入0.6mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；加蒸餾水0.4mL，混勻后于25℃，16000rpm離心10min，取上清測(cè)定。

3.        血清：直接測(cè)定。                  

測(cè)定操作：

計(jì)算公式：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y = 0.017x+0.0031，R² = 0.9991；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度：μg/mL；y為△A（A測(cè)定管-A空白管）

1. 按照蛋白含量計(jì)算

VB1含量（μg/mg prot）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷Cpr

                    = 58.8×（△A-0.0031）÷ Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

VB1含量（μg/g鮮重）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷（W÷V樣總）

                = 58.8×（△A-0.0031）÷ W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

VB1含量（μg/10⁴ cell）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷（細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）

                     = 58.8×（△A-0.0031）÷ 細(xì)胞數(shù)量

4. 按照液體體積計(jì)算

VB1含量（μg/mL）=（△A-0.0031）÷ 0.017

                  = 58.8×（△A-0.0031）

V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g

b．用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y = 0.0085x +0.0031，R² = 0.9991；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度：μg/mL；y為△A（A測(cè)定管-A空白管）

1. 按照蛋白含量計(jì)算

VB1含量（μg/mg prot）=（△A -0.0031）÷ 0.0085÷Cpr

                    = 117.65×（△A-0.0031）÷ Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

VB1含量（μg/g鮮重）=（△A-0.0031））÷ 0.0085÷（W÷V樣總）

                = 117.65×（△A-0.0031）÷ W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

VB1含量（μg/10⁴ cell）=（△A-0.0031）÷ 0.0085÷（細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）

                     = 117.65×（△A-0.0031）÷ 細(xì)胞數(shù)量

4. 按照液體體積計(jì)算

VB1含量（μg/mL）=（△A-0.0031）÷ 0.0085

                  = 117.65×（△A-0.0031）

V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g

注意事項(xiàng)：

1.        若測(cè)定結(jié)果中吸光值超過(guò)2，請(qǐng)將樣本稀釋后進(jìn)行測(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2.        蛋白濃度較高的樣品，比如動(dòng)物組織，若顯色完成后有沉淀產(chǎn)生，將樣本稀釋后再重新測(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

3.        顯色完成后立即進(jìn)行測(cè)定。

4.        標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍為0.1-10μg/mL。