亞鐵氧化酶（Hephaestin,HP）試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                        微量法100管/48樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

Hephaestin (HP)作為銅藍(lán)蛋白的同系物,是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞鐵氧化酶，HP屬亞鐵氧化酶家族成員,具有亞鐵氧化酶的活性,參與體內(nèi)鐵代謝。HP的表達(dá)可受鐵、銅及鋅等金屬離子的調(diào)節(jié)。HP催化Fe²⁺氧化生成Fe³⁺，在介導(dǎo)鐵的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中有重要作用。

測(cè)定原理：

HP催化Fe²⁺氧化為Fe³⁺，Fe²⁺和ferrozine反應(yīng)顯色，在560 nm下有特征吸光值。通過(guò)測(cè)定Fe²⁺的減少速率可測(cè)得亞鐵氧化酶的活性。

自備用品：

酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體60 mL×1瓶，4℃保存;

試劑二：液體1.5 mL×1瓶，4℃保存;

試劑三：液體11 mL×1瓶，4℃避光保存。

粗酶液提取：

按照組織質(zhì)量（g）：水（mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL蒸餾水），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至560 nm。

2. 在96孔板中加入下列試劑

HP活性計(jì)算:

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 8.2135x - 0.0006，R² = 0.9998；(x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μmol/mL；y為吸光值ΔA)

（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每g樣本每分鐘氧化1nmol Fe²⁺定義為一個(gè)酶活力單位。

HP（nmol/min/g 鮮重）=（△A+0.0006）÷ 8.2135×V總÷T ÷(W× V樣÷V樣總)× 1000

                       = 40.58×（△A+0.0006）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg蛋白每分鐘氧化1nmol Fe²⁺定義為一個(gè)酶活力單位。

HP（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0006）÷ 8.2135×V總÷T ÷（Cpr×V樣）

                       = 40.58×（△A+0.0006）÷Cpr

V總：反應(yīng)體系體積，0.1 mL；V樣：加入樣本體積0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；1000，μmol到nmol的轉(zhuǎn)換系數(shù)。