土壤中性磷酸酶（S-NP）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書

                                                     微量法100T/96S

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

土壤磷酸酶是催化土壤有機(jī)磷礦化的酶，其活性的高低直接影響著土壤中有機(jī)磷的分解轉(zhuǎn)化及其生物有效性，是評(píng)價(jià)土壤磷素生物轉(zhuǎn)化方向與強(qiáng)度的指標(biāo)。磷酸酶活性受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH的顯著影響，根據(jù)最適PH范圍，一般把土壤磷酸酶分為中性、酸性和堿性三種類型。

測(cè)定原理：

中性環(huán)境中，S-NP催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉，通過(guò)測(cè)定酚的生成量即可計(jì)算出NP活性。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、臺(tái)式離心機(jī)、37℃恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、冰、蒸餾水、乙醇和甲苯。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，4℃避光保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。用前加100mL蒸餾水充分溶解。

試劑三：液體×1瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加576μL無(wú)水乙醇（自備），24μL蒸餾水充分溶解。（變褐色后不能再使用）

標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1瓶，0.5 μmol/mL酚標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。

催化反應(yīng)：

稱取風(fēng)干混勻土壤約0.1g，加入50μL甲苯（自備），輕搖15min；加400μL試劑一并且搖勻后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，開(kāi)始計(jì)時(shí)，催化反應(yīng)24h；到時(shí)后迅速加入1mL試劑二充分混勻，以終止酶催化的反應(yīng)。8000g，25℃離心10min，取上清液置于冰上待測(cè)。

顯色反應(yīng)：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到660 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管：取微量玻璃比色皿/酶標(biāo)板，加入10μL蒸餾水，20μL試劑三，4μL試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水166μL，混勻后25℃靜置30min，于660nm測(cè)定吸光度，記為A空白管。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管：取微量玻璃比色皿/酶標(biāo)板，加入10μL標(biāo)準(zhǔn)液，20μL試劑三，4μL試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水166μL，混勻后25℃靜置30 min，于660nm測(cè)定吸光度，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 測(cè)定管：取微量玻璃比色皿/酶標(biāo)板，加入10μL上清液，20μL試劑三，4μL試劑四，充分混勻，顯色后再加蒸餾水166μL，混勻后室溫25℃30 min，于660nm測(cè)定吸光度，記為A測(cè)定管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。

S-NP活性計(jì)算：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

活性單位定義：37℃中每克土壤每天釋放1nmol酚為1個(gè)酶活單位。

S-NP（μmol/d/g 土樣）=[C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×V總÷W÷T

= 0.725×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)÷W

C標(biāo)準(zhǔn)液：0.5μmol/mL；V總：催化體系總體積，1.45mL；W：土壤樣品質(zhì)量，g；T：催化反應(yīng)時(shí)間，24 h=1 d。