檸檬酸（citric acid, CA）含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                               微量法100管/96樣

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

CA是生物體內(nèi)常見(jiàn)的有機(jī)酸，是重要的食品風(fēng)味物質(zhì)。此外，CA是三羧酸循環(huán)第一步反應(yīng)的產(chǎn)物。

測(cè)定原理：

酸性條件下，檸檬酸還原Cr⁶⁺生成Cr³⁺，在545nm處有特征吸收峰；通過(guò)測(cè)定545nm吸光值的增加，即可計(jì)算出樣品中檸檬酸含量。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

試劑組成和配置：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體×1管，－20℃保存。

試劑四：粉劑×1管，室溫保存。臨用前配制，加入2mL試劑一，充分溶解。

試劑五：液體×1管，4℃避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1管，250μmol/L檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。

樣品中檸檬酸提取：

1.        液體樣品中檸檬酸提?。喝?/span>0.1mL液體加試劑一0.9mL，充分混勻，11000g， 4℃離心10min，取上清液，待測(cè)。

2.        組織中檸檬酸提?。?/span>按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。11000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

3.        線粒體中檸檬酸提?。?/span>按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿，600g/min，4℃離心5min；取上清至另一EP管中，11000g，4℃離心10min，棄上清（此上清液可用于細(xì)胞質(zhì)CA含量測(cè)定）；向沉淀中加試劑二200μl，以及試劑三2μl，充分懸浮溶解，11000g，4℃離心10min，取上清液，待測(cè)。

4.        細(xì)菌、真菌中：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；11000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到545 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一置于30℃水浴中預(yù)熱30min。

3. 空白管：取0.5 mL EP管，依次加入20μL蒸餾水，140μL試劑一，20μL試劑四，20μL試劑五，混勻后室溫靜置30min，于545nm測(cè)定吸光度，記為A空白管。

4. 標(biāo)準(zhǔn)管：取0.5 mL EP管，依次加入20μL標(biāo)準(zhǔn)液，140μL試劑一，20μL試劑四，20μL試劑五，混勻后室溫靜置30min，于545nm測(cè)定吸光度，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

5. 測(cè)定管：取0.5 mL EP管，依次加入20μL上清液，140μL試劑一，20μL試劑四，20μL試劑五，充分混勻后室溫靜置30min，于545nm測(cè)定吸光度，記為A測(cè)定管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。

計(jì)算公式：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1.        按液體樣品的體積計(jì)算

檸檬酸含量（nmol/L）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×樣品稀釋倍數(shù)×V總

= 2500×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)

C標(biāo)準(zhǔn)液：250μmol/L=0.25 m mol/L；樣品稀釋倍數(shù)：（0.1 mL樣品+0.9mL試劑一）÷ 0.1 mL樣品=10；V總：1mL。

2.        按組織質(zhì)量計(jì)算

檸檬酸含量（nmol/g 鮮重）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×V總÷W

= 250×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷W

C標(biāo)準(zhǔn)液：250 μ mol/L；V總：上清液總體積，1.0 mL=0.001 L；W：樣品質(zhì)量，g。

3.        按蛋白含量計(jì)算

檸檬酸含量（nmol/mg prot）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]÷Cpr

= 250×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷Cpr

C標(biāo)準(zhǔn)液：250 μ mol/L=0.25μ mol/mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)含量，mg/mL。

4.        按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

檸檬酸含量（nmol/10⁴ cell）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×V總÷細(xì)胞數(shù)量

= 250×(A測(cè)定管－A空白管) ÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

C標(biāo)準(zhǔn)液：250 μ mol/L；V總：上清液總體積，1.0 mL=0.001 L；

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

3.        按液體樣品的體積計(jì)算

檸檬酸含量（nmol/L）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×樣品稀釋倍數(shù)×V總

= 2500×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)

C標(biāo)準(zhǔn)液：250μmol/L=0.25 m mol/L；樣品稀釋倍數(shù)：（0.1 mL樣品+0.9mL試劑一）÷ 0.1 mL樣品=10；V總：1mL。

4.        按組織質(zhì)量計(jì)算

檸檬酸含量（nmol/g 鮮重）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×V總÷W

= 250×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷W

C標(biāo)準(zhǔn)液：250 μ mol/L；V總：上清液總體積，1.0 mL=0.001 L；W：樣品質(zhì)量，g。

5.        按蛋白含量計(jì)算

檸檬酸含量（nmol/mg prot）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]÷Cpr

= 250×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷Cpr

C標(biāo)準(zhǔn)液：250 μ mol/L=0.25μ mol/mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)含量，mg/mL。

6.        按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

檸檬酸含量（nmol/10⁴ cell）= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×V總÷細(xì)胞數(shù)量

= 250×(A測(cè)定管－A空白管) ÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

C標(biāo)準(zhǔn)液：250 μ mol/L；V總：上清液總體積，1.0 mL=0.001 L；

注意事項(xiàng)：

1. 樣品處理等過(guò)程均需要在冰上進(jìn)行。

2. 試劑四需現(xiàn)配現(xiàn)用，配置好的一周內(nèi)使用完；

3. 試劑五為易致癌物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需佩戴手套，避免試劑五濺到皮膚上。

4. 檸檬酸提取液不能用于蛋白含量測(cè)定，如需測(cè)定蛋白含量，需另取組織，使用本公司BCA試劑盒進(jìn)行測(cè)定。