甲醛脫氫酶（Formaldehyde Dehydrogenase，FDH）試劑盒說明書

                                                      微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

甲醛是一種能與蛋白質(zhì)、核酸和脂類產(chǎn)生非特異性反應(yīng)的活潑化合物，對(duì)所有生物都具有很高毒性。甲醛脫氫酶作為含鋅中等鏈醇脫氫酶（ADH）的家庭成員之一，廣泛存在于原核和真核生物中，該酶能利用NAD⁺作為輔酶，將有毒的甲醛氧化，是甲醛氧化途徑中的關(guān)鍵酶。

測(cè)定原理：

甲醛脫氫酶催化甲醛和NAD⁺產(chǎn)生NADH，在340nm處的吸光值會(huì)增加，測(cè)定340nm處的吸光值變化，可計(jì)算得到甲醛脫氫酶的活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、96孔板、蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體15mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入6mL水溶解待用，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1支，4℃保存；臨用前加入1.5mL水溶解待用。

試劑四：液體1.5mL×1支，4℃避光保存。

FDH提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心20min。

2.        細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3.        液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作表：

1、   酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長至340nm。

2、   操作表

在96孔板中加入如下試劑

混勻，于340nm下測(cè)定初始吸光值A1與5min后的吸光值A2，△A=A2-A1。

若樣本數(shù)量較多，可將試劑按比例配成工作液使用。

FDH酶活計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘催化還原1nmol NAD⁺的酶量為1個(gè)酶活單位。

FDH酶活（nmol/min/mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T = 643×△A÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：每克樣品每分鐘催化還原1nmol NAD⁺的酶量為1個(gè)酶活單位。

FDH酶活（nmol/min/g 鮮重）= ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T =643×△A÷W

（3）按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化還原1nmol NAD⁺的酶量為1個(gè)酶活單位。

FDH酶活（nmol/min/10⁴cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)））÷T= 643×△A÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

酶活定義：每mL樣本每分鐘催化還原1nmol NAD⁺的酶量為1個(gè)酶活單位。

FDH酶活（nmol/min/mL）= ×V反總÷V樣÷T=643×△A

：NADH微摩爾消光系數(shù)，6.22×10^-3 L/µmol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T，反應(yīng)時(shí)間，5min；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g