一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                                      微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

NO（Nitric Oxide，NO）廣泛分布于生物體內(nèi)神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖等系統(tǒng)中，特別是神經(jīng)組織中較豐富。它作為細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)的信息物質(zhì)，發(fā)揮信號(hào)傳遞的作用，是一種新型的生物信使分子，在機(jī)體的生理、病理過(guò)程中起著重要的作用。

測(cè)定原理：

NO在體內(nèi)或水溶液中極易氧化生成NO₂^—，在酸性條件下，NO₂^—與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物，進(jìn)一步與萘基乙烯基二胺偶合，產(chǎn)物在550nm處有特征吸收峰，測(cè)定其吸光值，可以計(jì)算NO含量。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、研缽或勻漿器、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體6mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑二：液體6mL×1瓶，4℃避光保存。(用之前60℃加熱震蕩15min)

樣品處理：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。10000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測(cè)。

2.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心15min，取上清置于冰上待測(cè)。

3.        體液和培養(yǎng)液等其它液態(tài)樣品：直接測(cè)定。

測(cè)定步驟和操作表：

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550nm。

2、   操作表

NO含量計(jì)算：

a.        用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y= 0.016x -0.0103，R²= 0. 9986

1、組織樣品：

（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算

NO含量（μmoL/g 鮮重）=（ΔA +0.0103）÷0.016×V反總÷（V樣÷V樣總×W）×10^-3

                  = 0.125×（ΔA +0.0103）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算

NO含量（μmoL/mg prot）=（ΔA +0.0103）÷0.016×V反總÷（V樣×Cpr）×10^-3

                  = 0.125×（ΔA +0.0103）÷Cpr

2、細(xì)胞：

NO含量（μmol/10⁴ cell）=（ΔA +0.0103）÷0.016×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量）×10^-3

= 0.125×（ΔA +0.0103）÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

3、其他樣品：

NO含量（μmoL/L）=（ΔA +0.0103）÷0.016×V反總÷V樣                  

= 125×（ΔA +0.0103）

V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL

b.       用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y= 0.008x - 0.0103，R²= 0. 9986

1、組織樣品：

（1）按樣本重量計(jì)算

NO含量（μmoL/g 鮮重）=（ΔA +0.0103）÷0.008×V反總÷（V樣÷V樣總×W）×10^-3

                  = 0.25×（ΔA +0.0103）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算

NO含量（μmoL/mg prot）=（ΔA +0.0103）÷0.008×V反總÷（V樣×Cpr）×10^-3

                  = 0.25×（ΔA +0.0103）÷ Cpr

2、細(xì)胞：

NO含量（μmol/10⁴ cell）=（ΔA +0.0103）÷0.008×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量）×10^-3

= 0.25×（ΔA +0.0103）÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

3、   其他樣品：

NO含量（μmoL/L）=（ΔA +0.0103）÷0.008× V反總÷V樣= 250×（ΔA +0.0103）

V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL